Deși lupeolul nu a afectat în mod semnificativ viabilitatea celulelor HT-29, există studii care indică faptul că lupeolul joacă un rol în apoptoza mediată de TRAIL. Acest studiu a arătat că lupeolul, la 40 μM, a suprimat expresia proteinei inhibitoare celulare FLICE-like (cFLIP), un inhibitor al căii extrinseci a apoptozei, care previne formarea complexului de semnalizare care induce moartea (DISC) și activarea ulterioară de caspase-8. Pentru a confirma în continuare rolul căii extrinseci în apoptoza mediată de DRE, am comparat efectul DRE cu cel al lupeolului, în ceea ce privește abilitățile lor de a suprima expresia cFLIP. Analiza Western blot a arătat că DRE, la 2,5 mg / ml, a fost suficient pentru a inhiba expresia cFLIP în celulele canceroase. A existat un efect ușor aditiv atunci când DRE a fost combinat cu doza mai mică de lupeol, la 10 μM, confirmând din nou efectul benefic al mai multor componente din DRE, comparativ cu utilizarea componentelor individuale. Aceste rezultate au confirmat în continuare activitatea DRE prin calea extrinsecă a apoptozei. Acest studiu arată, pentru prima dată, potențialul anti-cancer al extractului de rădăcină apoasă de păpădie (DRE) în modele agresive de cancer de colon (in-vitro și in-vivo).

  Rezultatele noastre au arătat că DRE a redus selectiv activitatea metabolică a celulelor agresive ale cancerului de colon, indiferent de starea lor de p53. DRE a declanșat apoptoza în celulele cancerului de colon, fără efecte adverse asupra viabilității și supraviețuirii celulelor epiteliale ale mucoasei colonului necanceroase. Acest efect a fost clar distinct de celulele tratate cu combinațiile FOLFOX. Mai mult, administrarea sistemică de DRE nu a fost toxică pentru șoarecii care consumă apă suplimentată cu DRE pentru o perioadă de 3 luni. Cu toate acestea, administrarea orală de 3 luni a DRE a redus semnificativ creșterea tumorilor de colon la modelele de xenogrefă. Acestea sunt descoperiri noi care dezvăluie că DRE, într-o manieră dependentă de doză și timp, inhibă selectiv creșterea celulelor canceroase. Pentru evaluarea ulterioară a eficacității DRE ca agent preventiv și terapeutic, s-ar putea folosi modele de cobai transgenici susceptibili la dezvoltarea cancerului colorectal sau a cancerului colorectal indus chimic. Cu toate acestea, aceste rezultate indică faptul că DRE și componentele sale anti-cancer trebuie absorbite și circulate, pentru a ajunge la locul tumorii (pentru a inhiba creșterea tumorii). Unele studii sugerează că extractele de păpădie au activitate antioxidantă, pro-oxidantă și citotoxică în celulele adenocarcinomului de colon, Caco-2, putând în același timp să elimine speciile reactive de oxigen din celulele macrofagelor de șoarece, RAW264.7. Aceste efecte asupra stresului oxidativ sunt atribuite prezenței flavonoidelor în apă și a extractelor de acetat de etil. În acest studiu, am confirmat vulnerabilitatea mitocondriilor celulelor canceroase, arătând că tratamentul DRE a dus la o scădere a potențialului membranei mitocondriale și la creșterea nivelurilor ROS în mitocondriile izolate. Acest lucru a fost în concordanță cu rapoartele anterioare care sugerează că vulnerabilitatea mitocondriilor celulelor canceroase provine din fosforilarea oxidativă modificată și fluxul redus prin lanțul de transport al electronilor. În al doilea rând, am stabilit că destabilizarea indusă de DRE a membranelor mitocondriale a fost asociată cu o activare rapidă a caspazei-8. Interesant, am observat că, în urma tratamentului DRE, caspaza-8 activată a fost eliberată din mitocondrii în spațiul citoplasmatic și peri-nuclear, indicând faptul că pro-caspaza-8 poate locui în mitocondrii și la activare se poate transloca în alte locații din celule unde participă la progresia apoptozei. Aceste rezultate corespund celor raportate de Qin și colegi. Deși caspaza-8 a fost activată în timpul expunerii la DRE, nu a fost necesară pentru progresia apoptozei în celulele cancerului de colon, deoarece inhibitorul specific al caspazei-8, IETD-fmk, nu a modificat răspunsul DRE în aceste celule. Acest lucru a fost în contrast cu studiul nostru anterior asupra leucemiei și celulelor canceroase pancreatice. În mod clar, componentele extractului DRE pot stimula / inhiba alte căi de semnalizare în celulele canceroase ale colonului și pot induce apoptoza, ocolind cerința pentru caspaza-8. Folosind un set de căi de căutare, am observat că tratamentul DRE a indus expresia mai multor gene de moarte celulară, implicate atât în căile de moarte a celulelor apoptotice, cât și autofagice în HT-29. Aceste răspunsuri de expresie genică au indicat faptul că DRE ar putea angaja mai multe căi de semnalizare pentru a induce moartea celulelor programate (PCD) în celulele cancerului de colon.

  Mai mult decât atât, am observat expresia diferențială a genelor în celulele cancerului colorectal HT-29 și celulele epiteliale ale mucoasei colonului NCM460 normale, ca gene reglate în sus în celulele canceroase, au fost reglate în jos sau nu au fost exprimate în celule normale și invers.

  Astfel, citotoxicitatea specifică celulelor canceroase a DRE trebuie să provină din capacitatea sa de a implica mai multe elemente ale căilor de moarte celulară, dovadă fiind complexitatea profilurilor de expresie genică. Am abordat relevanța complexității moleculare a extractului DRE pentru proprietățile sale anti-cancer. Analiza fitochimică și testele biologice ale extractului de rădăcină de păpădie etanolică au condus la identificarea a patru compuși activi farmacologic, prezenți în două din cele șase fracții bioactive. Acestea au fost α-amirină, β-amirină, lupeol și taraxasterol, dintre care 3 sunt disponibile comercial - α-amirină, β-amirină, lupeol. La o doză mare, ≥ 10 μM, α-amirina a redus viabilitatea celulelor cancerului de colon; cu toate acestea, β-amirina și lupeolul nu au făcut-o. Mai mult, nu au existat interacțiuni sinergice între acești compuși și nici individual, nici în combinație nu ar prezenta o activitate anti-cancer, comparabilă cu cea a întregului DRE nefracționat. Descoperirile anterioare arată că taraxasterolul are activitate antiinflamatorie și chimiopreventivă, sugerând importanța sa în activitatea anticanceroasă a extractului de rădăcină de păpădie, în special la nivelurile de expresie ale COX-2. În plus, arătăm că 10 μM lupeol nu este foarte eficient pe cont propriu. Există o ușoară scădere a nivelurilor de cFLIP la această concentrație, dar efectul a fost clar remarcat la 40 μM, care este concentrația efectivă publicată pentru lupeol. La această concentrație, lupeolul poate sensibiliza celulele cancerului pancreatic la apoptoza indusă de TRAIL, prin inhibarea expresiei cFLIP, un inhibitor al căii extrinseci a apoptozei. Ca rezultat, este de înțeles că nu vedem o scădere a viabilității celulelor HT-29 cu doar 10 μM lupeol. În studiul de față, am constatat că DRE nefracționat a avut un efect mai puternic asupra reducerii expresiei cFLIP în HT-29, decât lupeolul singur. Acesta a fost un răspuns dependent de doză și timp. Aceste rezultate au confirmat în continuare că activitatea anticanceroasă a DRE a rezultat din capacitatea sa de a activa calea extrinsecă a apoptozei și chiar dacă etapele moleculare ale căii ar putea fi specifice tipului de celule, compoziția multi-componentă a acestui extract este responsabilă de bioactivitatea sa generală. CONCLUZII Rezultatele noastre au arătat că extractul apos de rădăcină de păpădie (DRE) declanșează în mod eficient și selectiv căi de moarte celulară programate în modele de cancer colorectal in vitro și in vivo. Rezultatele au confirmat ipoteza noastră că complexitatea moleculară a extractului DRE este responsabilă pentru activitatea sa anti-cancer, deoarece permite angajarea mai multor căi de semnalizare în celulele canceroase, inclusiv mitocondriile. Prin urmare, putem concluziona că DRE, ca amestec complex, ar putea oferi o alternativă complementară la chimioterapiile disponibile în prezent.

 Cu aceste rezultate, extractul din rădăcină de păpădie (DRE) este aprobat de Health Canada pentru studii clinice de fază I în cazurile de cancer hematologic. Utilizarea lor s-ar putea dovedi nu numai eficientă, ci și asociată cu efecte secundare mai puține și mai puțin severe și, astfel, îmbunătățește calitatea vieții și, eventual, crește durata de viață a pacienților cu cancer.