Cercetări în domeniul cancerului

Rădăcina de păpădie inhibă cancerul colorectal (I)

Scris de Ayurvedic Medica

Introducere

 Extractul de păpădie a fost studiat pe larg în ultimii ani pentru activitatea sa anticancerigenă, antidepresivă și antiinflamatoare. Lucrări recente din laborator, cu sisteme in-vitro, arată potențialul anticancer al unui extract de rădăcină apoasă de păpădie (DRE) în mai multe modele de celule canceroase, fără toxicitate pentru celulele necanceroase.

 În acest studiu, cercetătorii au examinat eficacitatea uciderii celulelor canceroase a unui DRE apos în modelele de celule canceroase ale colonului. DRE apoasă a indus moartea celulară programată (PCD) selectiv în >95% din celulele canceroase ale colonului, indiferent de starea lor de p53, până la 48 de ore de tratament.

 Eficacitatea anticanceroasă a acestui extract a fost confirmată în studii in-vivo, deoarece administrarea orală de DRE a întârziat creșterea modelelor de xenogrefă de colon uman cu mai mult de 90%. Cercetătorii au găsit activarea mai multor căi de deces în celulele canceroase prin tratamentul DRE, după cum s-a evidențiat prin analize ale expresiei genelor care arată expresia genelor implicate în moartea celulară programată.

 Analizele fitochimice ale extractului de rădăcină de păpădie au arătat o compoziție complexă multi-componentă a DRE, incluzând unele fitochimice bioactive cunoscute, cum ar fi α-amirină, β-amirină, lupeol și taraxasterol. Acest lucru a sugerat că acest extract natural ar putea angaja și viza în mod eficient vulnerabilitățile multiple ale celulelor canceroase. Prin urmare, DRE ar putea fi o alternativă anticanceroasă non-toxică și eficientă, instrumentală pentru reducerea apariției rezistenței la medicamente a celulelor canceroase.

 Creșterile populației în vârstă ale lumii, precum și adoptarea comportamentelor cauzatoare de cancer, sunt factorii principali care contribuie la o escaladare globală a diferitelor forme de cancer. Există peste 12 milioane de cazuri noi de cancer care apar anual și peste 7 milioane de decese legate de cancer la nivel mondial și chiar și cu introducerea multor abordări chimioterapice și chimiopreventive, cancerul este încă una dintre principalele cauze de decese în lume astăzi, cu o statistică din unul din patru decese fiind atribuit numai cancerului.

 În ciuda progreselor înregistrate în dezvoltarea și introducerea multor agenți de chimioterapie, toxicitățile și efectele secundare însoțitoare indică necesitatea unor cercetări suplimentare pentru a reduce incidența ratelor de cancer și cantitatea de decese cauzate de cancer, precum și pentru a îmbunătăți calitatea vieții pacienților deja diagnosticați cu boala. Produsele naturale de sănătate (NHP) și produsele naturale (PN) au fost esențiale în dezvoltarea multor medicamente, peste 75% din chimioterapiile disponibile în prezent fiind derivate din surse naturale (plante, microbi și surse marine).

 Acești PSN au fost utilizați în diferite medicamente tradiționale, iar studiile recente privind utilizarea PSN pentru boli specifice dau unele validări științifice pentru aplicarea lor. Chiar și cu toate dovezile primite, medicamentele pe bază de plante și alte NHP și NP sunt de obicei evitate în timpul chimioterapiei sistemice din cauza unei posibile interacțiuni plante-medicamente care ar putea spori toxicitatea legată de chimioterapie.

 Păpădia (Taraxacum spp) a fost folosită de secole pentru tratamentul diferitelor afecțiuni; în mod surprinzător, au primit puțină atenție de cercetare. Unele studii științifice raportează activități anti-inflamatorii, anti-oxidative și diuretice ale diferitelor părți ale acestei plante. Studii recente din laboratorul nostru arată o activitate anticanceroasă puternică a unui extract apos de rădăcină de păpădie (DRE). S-a constatat că DRE este capabil să inducă o activare rapidă a căii extrinseci mediate de receptorul morții al apoptozei în leucemia umană și celulele canceroase pancreatice într-o manieră dependentă de doză și timp. Mai mult, inducerea apoptozei este dependentă de activarea caspazei-8. Datele noastre arată că această acțiune a DRE este selectivă pentru celulele canceroase, deoarece același tratament nu dăunează celulelor necanceroase.

 Cu toate acestea, analizele detaliate ale eficacității și toxicității acestui extract în modele in-vivo și ex-vivo, precum și mecanismul (mecanismele) sale de acțiune rămân încă neexplorate. Mai mult, componentele anticancerigene farmacologic active ale acestui extract sunt în prezent necunoscute. Raportăm activitatea anticanceroasă a DRE obținută cu modele in-vitro (linii celulare de cancer de colon) și in-vivo (model de xenogrefă de cobai cu cancer de colon).

 S-a emis ipoteza că, datorită complexității sale compoziționale (amestec de bioactivi), DRE ar putea fi capabil să activeze diferite evenimente de semnalizare și să inducă mai eficient procese de moarte celulară program (PCD), vizând diferite vulnerabilități metabolice ale celulelor canceroase. În consecință, s-a arătat că, deși tratamentul DRE a declanșat moartea celulară în toate modelele de celule examinate și a condus la activarea și localizarea caspazei-8 active în mitocondrie și spațiul peri-nuclear, această activare a caspazei-8 nu a fost esențială pentru inducerea morții celulare în celulele cancerului de colon ca inhibare a activării caspazei-8 nu a modificat citotoxicitatea DRE. Prin urmare, în celulele cancerului colorectal, tratamentul DRE trebuie să fi utilizat calea morții celulare independente a caspazei-8.

 Prin urmare, în celulele cancerului colorectal, tratamentul DRE trebuie să fi utilizat calea morții celulare independente a caspazei-8. Am reușit să identificăm patru componente farmacologic active, α-amirină, β-amirină, lupeol și taraxasterol, în două din cele șase fracțiuni bioactive, dar activitățile anticanceroase ale compușilor individuali nu au fost la fel de puternice ca cea a DRE nefracționat care indică, în mod clar, beneficiile utilizării întregului extract. Luate împreună, rezultatele validează științific utilizarea NHP-urilor, în special a extractelor de rădăcină de păpădie, ca potențiali agenți anti-cancer, care ar putea reprezenta o alternativă nouă non-toxică la terapia convențională a cancerului disponibilă astăzi.

Extractul din rădăcină de păpădie (DRE) induce apoptoza în celulele canceroase agresive

 Această activitate inducătoare de apoptoză a DRE, după cum s-a raportat anterior, a determinat studii suplimentare privind eficacitatea acesteia în celulele cancerului colorectal extrem de agresive, HT-29 (p53 - / -) și HCT116 (p53 WT).

 Pentru comparație, celulele epiteliale ale mucoasei colonului normal (NCM460) au fost, de asemenea, utilizate pentru a evalua selectivitatea DRE față de celulele cancerului colorectal. Mai mult, am comparat eficacitatea DRE cu chimioterapia utilizată în prezent pentru cancerul de colon, FOLFOX (5-fluorouracil, acid folinic și oxaliplatină). Am observat o scădere semnificativă a viabilității atât a celulelor cancerului colorectal HT-29, cât și a HCT116 în urma tratamentului DRE.

 Această reducere a viabilității metabolice a corespuns unei creșteri a inducerii apoptozei, deoarece tratamentul cu DRE a declanșat apoptoza selectiv în celulele cancerului de colon, dar nu și în celulele mucoasei normale.

 Aceste rezultate indică în mod clar că extractul de rădăcină de păpădie poate inhiba capacitatea celulelor canceroase colorectale de a migra și invada și, prin urmare, metastaza în locații secundare.

 După cum s-a descris mai sus, studiile in vitro au dovedit că DRE a indus apoptoza selectivă în celulele canceroase; distingându-se astfel între celulele canceroase și necanceroase. Următoarea întrebare a fost dacă DRE a fost sigur de utilizat in-vivo și dacă ar putea fi eficient împotriva tumorilor crescute ca xenogrefe.

Extractul din rădăcină de păpădie distruge mitocondriile celulelor canceroase

 Puține studii au încercat să delimiteze mecanismul de acțiune al extractelor de păpădie, în special în celulele canceroase. Anterior, am arătat că DRE nu induce leziuni ale ADN-ului în celulele canceroase. Cu toate acestea, ca și în studiile anterioare, am observat o perturbare a potențialului membranei mitocondriale în urma tratamentului DRE al celulelor cancerului de colon. Pe de altă parte, mitocondriile celulelor NCM460 au rămas neafectate. Aceste răspunsuri au fost cuantificate și confirmate prin citometrie bazată pe imagini, care a arătat în mod clar o scădere a intensității fluorescenței roșii, indicativă a pierderii potențialului membranei mitocondriale, în celulele HT-29, fără nicio diferență între probele martor și cele tratate cu DRE.

 De asemenea, s-a observat că tratamentul DRE al mitocondriilor izolate din celulele NCM460 nu a produs cantități semnificative de ROS. Astfel, se pare că DRE poate viza defectele metabolice și/sau răspunsul mitocondrial ROS în celulele canceroase, pentru a determina selectivitatea pentru distrugerea celulelor canceroase.

 Studiile anterioare au arătat că tratamentul DRE activează rapid și eficient calea extrinsecă a apoptozei în leucemie, melanom și celule de cancer pancreatic și acest proces este dependent de activarea caspazei-8 ca celule cu un domeniu de moarte asociat Fas-dominant negativ (Dn-FADD) nu răspund la tratamentul DRE.

 Deoarece s-a observat destabilizarea membranei mitocondriale în celulele cancerului de colon tratate cu DRE, am dorit să confirmăm legătura dintre activarea caspazei-8 și pierderea potențialului membranei mitocondriale.

 Rezultatele au arătat o destabilizare progresivă a membranei mitocondriale în urma tratamentului DRE, care a fost observată încă din 30 de minute după tratament. Rezultatele au arătat că citotoxicitatea a apărut chiar și în prezența inhibitorului caspazei-8, IETD-fmk și pierderea corespunzătoare a viabilității celulelor HT-29 ca răspuns la tratamentul DRE a fost dependentă de doză și de timp, sugerând că în HT-29 celulele canceroase colorectale, moartea celulelor induse de DRE a fost independentă de caspaza-8.

Extractul din rădăcină de păpădie induce apoptoza celulară

 Din moment ce DRE a declanșat moartea celulară a celulelor canceroase de colon părea a fi caspază-8 independentă, am procedat la examinarea efectelor sale asupra genelor legate de moartea celulară a expresiei pentru a descoperi alte aspecte ale acțiunii DRE.

 Folosindu-se sistemul PCR RT2 Profiler Cell Death Pathway Finder, am analizat profilurile de expresie a 84 de gene cheie din mecanismele centrale pentru moartea celulelor apoptotice, autofagice și necrotice pentru a determina în continuare diferențele în răspunsul celulelor colorectale la DRE și pentru a investiga în continuare selectivitatea DRE către celulele canceroase, studiul expresiei genei a fost realizat în celulele HT-29 și NCM460.

 S-a observat că tratamentul cu DRE a avut efecte opuse asupra cancerului și celulelor necanceroase, când a venit vorba despre modul în care exprimă genele morții celulare, deoarece genele morții celulare supraexprimate în celulele HT-29 după tratament, au fost reglate în jos în celulele NCM460 sub aceleași condiții și invers. În acest studiu, am constatat că tratamentul DRE a condus la reglarea în sus a genelor pro-moarte în celulele HT-29, inclusiv caspaza 1, KCNIP1, SNCA, TNF și unii dintre receptorii săi corespunzători, TNFRSF1A și TNFRSF11B. În paralel, observăm o reglare descendentă a genelor pro-supraviețuire, în special a genelor anti-apoptotice, Bcl-2, Bcl-2A1 și PARP2. În același timp, expresia acestor gene în celulele NCM460 necanceroase nu a arătat o schimbare drastică față de celulele NCT460 de control netratate.

 Mai mult, acolo unde au existat modificări în expresia genică a celulelor NCM460, modelul a fost direct opus celui al celulelor canceroase HT-29. Această creștere a expresiei genetice nu a fost limitată la o cale majoră, deoarece am observat creșteri ale expresiilor genelor implicate în apoptoză și autofagie, indicând faptul că DRE a atins mai multe ținte în celulele canceroase. Acest lucru a confirmat în continuare legăturile dintre diferitele forme de moarte celulară programată. Următorul pas în evaluarea suplimentară a direcționării diferențiale a celulelor cancerului colorectal a fost să se determine dacă modificările nivelurilor de ARNm au corespuns modificărilor nivelurilor de proteine. Nu este surprinzător, nivelurile de proteine, inclusiv Bcl-2A1, Bcl-xL, Parp-2, TMEM57 și ULK1 au corespuns nivelurilor de ARNm obținute în timpul analizei expresiei genei. Mai mult, am dorit să evaluăm alți actori majori în supraviețuirea celulelor canceroase de colon, inclusiv ERK1 / 2, Grb 2 și COX-2.

 Am observat o scădere a ERK1/2 nuclear și o creștere corespunzătoare a nivelurilor de ERK1/2 citoplasmatic. Acest lucru corespunde cu descoperirile care arată că localizarea nucleară a ERK1/2 este esențială pentru proliferarea celulară, în timp ce localizarea citoplasmatică a ERK1/2 este necesară pentru inducerea apoptozei. Grb 2, o proteină adaptor necesară pentru activarea ERK1/2 care ulterior se translocează în nucleu, s-a dovedit a fi scăzută, de asemenea. Ciclooxigenaza-2 (COX-2) este un promotor major al cancerului colorectal și este supra-exprimat în peste 50% din cancerele de colon. Această proteină are, de asemenea, un impact major asupra diferitelor căi de semnalizare.

 Tratamentul cu DRE a scăzut selectiv expresia COX-2 în celulele cancerului de colon într-o manieră dependentă de doză și timp, arătând potențialul său ca extract antiinflamator. Aceste rezultate prezintă versatilitatea extractului de rădăcină de păpădie, care este capabil să vizeze mai multe căi programate de moarte celulară, precum și căi de semnalizare aberante, selectiv în celulele canceroase ale colonului. Acest lucru arată în plus că DRE a reușit să facă distincția între celulele canceroase și celulele necanceroase (colon) pentru a obține citotoxicitate selectivă pentru celulele canceroase, fără toxicitate asociată pentru celulele necanceroase.

Analiza fitochimică a extractului de rădăcină de păpădie

 Pentru a începe analiza fitochimică, rădăcina de păpădie a fost extrasă și fracționată folosind o coloană de silicagel. Fracțiile obținute au fost apoi testate pentru bioactivitate, prin testul de viabilitate celulară WST-1. Rezultatele studiilor de fracțiune au fost comparate cu cele obținute în urma testării bioactivității extractului etanolic din rădăcină de păpădie. Testele de bioactivitate au identificat 6 din 26 de fracții cu activitate semnificativă, comparabile cu întregul extract etanolic.

 După identificarea fracțiilor bioactive, aceste fracții active au fost fracționate în continuare pentru a obține fracții secundare (28) printr-o coloană HPLC preparativă. Testele suplimentare de bioactivitate au restrâns numărul fracțiilor bioactive. Fracțiile bioactive identificate au fost analizate prin UPLC-DAD-MS, utilizând un amestec standard, pentru a identifica diferiții compuși din fracțiuni. Acest lucru a condus la identificarea a patru componente majore în cadrul a două dintre fracțiunile bioactive (Fracțiunea # 5 și # 6); α-amirină, β-amirină, lupeol și taraxasterol. Aceste date au confirmat prezența mai multor componente bioactive în DRE care ar putea potența activitatea sa citotoxică împotriva celulelor canceroase.